① wb蛋白樣品弄混怎麼區分
區分不了，除非有分子測定儀可以測定出分子質量和構成來確定哪種蛋白是哪種蛋白，否則的話只能重新做一份了，下次一定注意把WB蛋白的區別放置，當進行接觸濾紙、凝膠和膜的操作時，應戴手套。手上的油脂會阻斷轉移，提蛋白一定要過硬，不能吝惜蛋白酶抑制劑，測定蛋白濃度一定要選好方法，最重要的，wb的成功最大程度的依賴於sds-page，最好有預染marker。
拓展內容：
有效的樣品制備是影響WB可重復性的非常重要的因素。需考慮以下問題：
1、靶蛋白是可溶/不可溶蛋白，細胞質/膜蛋白？
2、溶解的蛋白或其翻譯後修飾的維持是否需要添加額外的緩沖成分(例如洗滌劑、酶抑制劑)？
3、蛋白質定量的方法是什麼，緩沖成分會干擾蛋白定量嗎？BCA蛋白定量檢測法是總蛋白質定量的常用方法，其蛋白間差異較考馬斯染料法的更小，但與還原劑、螯合劑不兼容（兼容去垢劑）。
小分子量蛋白的轉膜需要注意：
（1）高濃度的凝膠有利於小分子量蛋白的分離。一般在目的蛋白離凝膠前沿0.5-1cm時停止電泳，太靠近凝膠前沿易引起邊緣效應。
（2）SDS阻止蛋白與膜的結合，小蛋白更是如此。因此電轉液中可以不加SDS。
（3）保持甲醇濃度20%。
大分子量蛋白的轉膜需要注意：
（1） 而甲醇易使SDS從蛋白上脫離，因此適當降低甲醇濃度至10%或更低，防止蛋白沉澱。
（2） 降低電轉液中甲醇的含量，這樣可以促進凝膠的膨脹，更易於大分子量蛋白的轉出。
（3） 使用硝酸纖維素膜時，甲醇是必需的。如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉液，但需要預先用甲醇活化。
② β-胡蘿卜素的提取方法
利用不同胡蘿卜素在層析液中的溶解度不同，採用紙層析法提取B-胡蘿卜素。
具體步驟如下：
1、選取500 g新鮮的胡蘿卜，用清水洗凈，瀝干、切碎，然後在40 ℃的烘箱中烘乾，時間約需2 h，將乾燥後的胡蘿卜進一步粉碎過篩。注意胡蘿卜的粉碎一定要徹底。
2.將樣品放入500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL石油醚混勻，按教科書中圖6-7所示安裝萃取迴流裝置，萃取30 min，然後過濾萃取液，除去固體物質。
3.安裝蒸餾裝置，對萃取的樣品進行濃縮。
4.收集接受器中的樣品，觀察樣品的顏色和氣味，並通過紙層析進行鑒定。層析時注意選擇干凈的濾紙，為了防止操作時對濾紙的污染，應盡量避免用手直接接觸濾紙，可以帶手套進行操作。點樣時應注意點樣斑點不能太大（直徑應小於0.5 cm），如果用吹風機吹乾，溫度不宜過高，否則斑點會變黃。將點好樣的濾紙捲成筒狀，卷紙時注意濾紙的兩邊不能相互接觸，以免因毛細管現象導致溶劑沿濾紙兩邊的移動加快，溶劑前沿不齊，影響結果。
③ 紙層析實驗的實驗步驟及現象
氨基酸的紙層析 一、 實驗目的 1.了解並掌握氨基酸紙層析的原理和方法。 2.學習紙層析法的操作技術，分析未知樣品氨基酸的成分。 二、 實驗原理 用濾紙為支持物進行層析的方法，稱為紙層析法，它是分配層析法的一種。紙層析所用的展層溶劑大多是由水飽和的有機溶劑組成。濾紙纖維的—OH 基的親水性基團，可吸附有機溶劑中的水作為固定相，有機溶劑作為流動相，它沿濾紙自下向上移動，稱為上行層析；反之，使有機溶劑自上而下移動，稱為下行層析。將樣品點在濾紙上進行展層，樣品中的各種氨基酸即在二相中不斷進行分配，由於它們各自的分配系數不同，故在流動相中移動速率不等，從而使不同的氨基酸得到分離和提純。紙層析法主要是依據混合組分對二相分配系數的差異進行分離，但亦存在著某種程度的吸附作用和離子交換現象。氨基酸經層析在濾紙上形成距原點不等的層析點，氨基酸在濾紙上的移動速率用Rf 表示。 Rf = 原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離 只要實驗條件(如溫度、展層溶劑的組分、pH、濾紙的質量等)不變，Rf 值是常數，因此可做定性分析參考。如果溶質中氨基酸組分較多或其中某些組分的Rf 值相同或近似，用單向層析不宜將它們分開，為此可進行雙向層析，在第一溶劑展開後將濾紙轉動90度，以第一次展層所得的層析點為原點，再用另一種溶劑展層，即可達到分離目的。由於氨基酸無色，可利用茚三酮反應使氨基酸層析點顯色，從而定性和定量。 三、儀器和試劑 儀器 層析濾紙、燒杯、剪刀、層析缸、培養皿、猴頭噴霧器、微量加樣器或毛細管、吹風機一個、直 尺、鉛筆等。 試劑 1.混合氨基酸溶液(水解後的氨基酸乾粉) 甘氨酸溶液：50mg 甘氨酸溶於5mL 水中。 蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶於5mL 水中。 亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶於5mL 水中。 氨基酸混合液： 甘氨酸50mg，亮氨酸25mg，蛋氨酸25mg 共溶於5mL 水中。 2.展層溶劑 鹼相溶劑：正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇 = 13∶13∶13(V/V) 酸相溶劑：正丁醇∶80%甲酸∶水 = 15∶3∶2(V/V)，搖勻後放置半天以上，取上清液備用。 3.顯色貯備液： 0.4mol/L 茚三酮—異丙醇∶甲酸∶水=20∶1∶5。 4.0.1%硫酸銅：75%乙醇=2∶38，臨用前按比例混合。 四、實驗步驟 (1)標准氨基酸單向上行層析法 1.畫基線 戴上指套或橡皮手套，在長約20cm、寬約17cm 濾紙上，距短邊2.5cm 處，用鉛筆畫一條線，即為基線。 2.點樣 在原線上，從距紙的長邊4cm處開始，每隔3cm 用微量注射器或毛細管依次分別點上甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和混合氨基酸溶液。點樣點干後可重復點加1～2次。每一點的直徑不超過2mm，點樣量以每種氨基酸含5～20ug 為宜。 3.展層 將點好樣的濾紙捲成筒形，濾紙兩邊不相接觸，用線固定好，將原線的下端浸入盛有溶劑的培養皿中，不需平衡可立即展層。展層劑為酸性溶劑系統，在展層溶劑中加入顯色貯備液(每10mL 展層劑加0.1～0.5mL 的顯色貯備液)進行展層，基線必須保持在液面之上，以免氨基酸與溶劑直接接觸。蓋好層析缸，當溶劑前沿距紙端2cm 時(大約3h)，取出濾紙。 4.顯色 濾紙取出後，吹乾或在80℃左右烘箱內烘3～5min，即出現紫紅色的氨基酸層析 斑點。用鉛筆劃下層析斑點，可進行定性、定量測定。 (2)混合氨基酸雙向上行紙層析法 1.濾紙准備 將濾紙裁成約28cm2的正方形，在距濾紙相鄰兩邊各2cm 處的交點上，用鉛筆劃下一點，做為原點。 2.點樣 取混合氨基酸溶液(5mg/mL)10～15μL，分別點在原點上。 3.展層與顯色 將點好樣的濾紙捲成半筒形，立在培養皿中，原點應在下端。取少量12%的氨水與小燒杯中，蓋好層析缸，平衡過夜。次日，取出氨水，加適量鹼相溶劑(第一向)與培養皿中，蓋好層析缸，上行展層，當溶劑前沿距濾紙上端1～2cm 時，取出濾紙，冷風吹乾。將濾紙轉90o，再捲成半筒形，豎立在干凈培養皿中，並於小燒杯中至少量酸相溶劑，蓋好層析缸，平衡過夜，次日將加顯色劑的酸性溶劑(每10mL 展層劑加0.1～0.5mL 的顯色貯備液)傾入培養皿中，進行第2向展層。展層畢，取出濾紙，用熱風吹乾，藍紫色斑點即顯現。 五、計算 單向層析的Rf 值，按 「Rf = 原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離」計量後計算。雙向層析Rf 值，由兩個數值組成，在第一向計量一次，第二向計量一次，分別與已知的氨基酸在酸鹼系統的Rf 值對比，即可初步決定它為何種氨基酸的斑點，將它剪下，在同一張紙剪下一塊大小相同的空白紙作為對照，用硫酸銅—乙醇溶液洗脫，用722型分光光度計測定其吸光度，在標准曲線上查出氨基酸的含量。
④ 實驗室有毒試劑
丙酮
龍膽紫
丙烯醯胺（電泳用的，高中書里有)
還有一些重金屬鹽和酸不知道會不會接觸
⑤ 空氣濾芯如何更換
打開引擎蓋，找到空氣濾芯盒，一般位於發動機側邊有管道連接，打開濾芯盒罩，取出舊的濾芯，將濾芯盒清理干凈，裝上新的濾芯，原位裝回，蓋上濾芯盒罩即可。
發動機在工作過程中要吸進大量的空氣，如果空氣不經過濾清，空氣中懸浮的塵埃被吸入氣缸中，就會加速活塞組及氣缸的磨損。
較大的顆粒進入活塞與氣缸之間，會造成嚴重的「拉缸」現象，這在乾燥多沙的工作環境中尤為嚴重。空氣濾清器裝在化油器或進氣管的前方，起到濾除空氣中灰塵、砂粒的作用，保證氣缸中進入足量、清潔的空氣。
一般根據使用的原材料的不同，濾芯的使用壽命也是不同的，但是隨著使用時間的延長，水中的雜質會堵塞濾芯，所以一般來說PP濾芯三個月需要更換。
活性炭濾芯六個月需要更換;而纖維濾芯由於不能清洗，一般都放置在PP棉和活性炭的後端使用，不易造成堵塞;陶瓷濾芯通常可以使用9-12個月。
設備中的濾紙也是關鍵之一，優質過濾設備中的濾紙通常採用充滿合成樹脂的超細纖維紙，它能夠做到有效過濾雜質並且蓄污能力強。根據相關的統計，一輛輸出功率為180千瓦的客車在三萬公里的行駛中，被過濾設備過濾掉的雜質約為1.5公斤。
⑥ 用分配層析法分離氨基酸應注意哪些問題,為什麼
氨基酸的分離鑒定——紙層析法
一,實驗目的
掌握氨基酸紙層析的方法和原理,學會分析待
測樣品的氨基酸成分.
二,實驗原理
紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析.濾紙纖維上的羥基具有親水性,吸附一層水作為固定相,有機溶劑為流動相.當有機相流經固定相時,物質在兩相間不斷分配而得到分離.
溶質在濾紙上的移動速度用Rf值表示:
Rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質的Rf值是常數.Rf值的大小與物質的結構,性質,溶劑系統,層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關.本實驗利用紙層析法分離氨基酸.
三,實驗器材
(1)大燒杯(5000mL):1隻/組
(2)微量注射器(100 L):1隻/ 組.
(3)噴霧器:公用.
(4)培養皿:1隻/組.
(5)層析濾紙(長22cm,寬14cm的新華一號濾紙):1張/組.
(6)直尺,鉛筆:自備.
(7)電吹風:1隻/組.
(8)托盤,針,白線:1套/組.
(9)手套:1雙/組.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小燒杯:50mL,1隻/組.
四,實驗試劑
(1)擴展劑:將4體積正丁醇和1體積冰醋酸放入分液漏斗中,與5體積水混合,充分振盪,靜置後分層,棄去下層水層.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3種(賴氨酸,苯丙氨酸,纈氨酸),0.5%的待測氨基酸液1種.
(3)顯色劑:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
實驗試劑
五,實驗操作
檢查培養皿是否乾燥,潔凈;若否,將其洗凈並置於乾燥箱內120℃烘乾.
(1)平衡:剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上,將層析缸或大燒杯到置於塑料薄膜上,再把盛有約20mL展層溶液的小燒杯置於倒置的層析缸或大燒杯中,用塑料薄膜密封起來,平衡20min.
(2)規劃:帶上手套,取寬約14cm,高約22cm的層析濾紙一張.在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平行於底邊的直線A,在直線上做4個記號,記號之間間隔2cm,這就是原點的位置.另在距左邊緣1cm處畫一條平行於左邊緣的直線B,在B線上以A,B兩線的交點為原點標明刻度(以厘米為單位),參見左圖.
(3)點樣:用微量注射器分別取10mL左右的氨基酸樣品(每取一個樣之前都要用蒸餾水洗滌微量注射器,以免交叉污染),點在這四個位置上.擠一滴點一次,同一位置上需點2～3次,2～3mL/次,每點完一點,立刻用電吹風熱風吹乾後再點,以保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm.每人須點4個樣,其中3個是已知樣,1個是待測樣品.
(4)層析:用針,線將濾紙縫成筒狀,紙的兩側
邊緣不能接觸且要保持平行,參見圖3-3.向培養皿中加入擴展劑,使其液面高度達到1cm左右,將點好樣的濾紙筒直立於培養皿中(點樣的一端在下,擴展劑的液面在A線下約1cm),罩上大燒杯,仍用塑料薄膜密封.當擴展劑上升到A線時開始計時,每隔一定時間測定一下擴展劑上升的高度,填入表3-1中.當上升到15～18cm,取出濾紙,剪斷連線,立即用鉛筆描出溶劑前沿線,迅速用電吹風熱風吹乾.
(5)顯色:用噴霧器在通風廚中向濾紙上均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然後立即用熱風吹乾,即可顯出各層析斑點,參見左圖.
(6)計算各種氨基酸的Rf值,並判斷混合樣品中都有哪些氨基酸,各人將自己的實驗結果貼在實驗報告上,見表3-2.
(7)以層析時間為橫坐標,擴展劑上升高度為縱坐標畫圖,求出擴展劑上升到18cm時所需要的時間.
(8)將微量注射器內外用蒸餾水清洗干凈,倒掉用過的展層液和平衡液,將培養皿洗凈,整理好桌面上的儀器和試劑
⑦ Acr/Bic作用
Western-Blot操作流程
試劑配製
（一）母液
1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g
蒸餾水 200ml
溶解後，用濃鹽酸調pH至所需點（見下所示），最後用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌後室溫下保存。 PH HCl
7.4 約17ml
7.5 約16m
7.6 約15ml
8.0 約10ml
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g
異丙醇 100ml
溶解後，分裝於1.5ml離心管中，-20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸餾水至 500ml
溶解後，高壓滅菌，室溫保存。
0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO·12H2O（MW 358.14） 71.6g
蒸餾水至 1000ml
溶解後，高壓滅菌，室溫保存。
10％SDS SDS 10g
蒸餾水至 100ml
50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現沉澱，水浴溶化後，仍可使用。
10％過硫酸胺（AP） 過硫酸胺 0.1g
超純水 1.0ml
溶解後，4℃保存，保存時間為1周。
（可先將過硫酸胺乾粉稱好分量後放在EP管中，一次性多裝幾管，使用時加入超純水即可）
1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g
超純水 200ml
溶解後，用濃鹽酸調pH至8.8，最後用超純水定容至250ml，室溫下保存。
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g
超純水 200ml
溶解後，用濃鹽酸調pH至6.8，最後用超純水定容至250ml，室溫下保存。
40％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀醯胺（Acr） 37.5g
甲叉雙丙稀醯胺（Bic） 1g
超純水至 100ml
溶解後4℃保存。使用時恢復至室溫且無沉澱。
20％Tween20 Tween20 20ml
蒸餾水至 100ml
混勻後4℃保存。
（二）使用液
單去污劑裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX-100 0.5ml
蒸餾水至 50ml
混勻後4℃保存。使用時，加入PMSF至終濃度為100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
（一般實際用的比較多的其實是RIPA裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS。至於其中每個要加多少量那就自己去算吧，因為本人已經算好的配方表無意間弄丟了）
0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO 19ml
0.2 mol/L NaHPO4 81ml
NaCl 17g
蒸餾水至 2000ml
（如果用TBST進行洗膜的話，其實PBS用得很少，大可不必自己配製，向試劑公司購買20×的PBS濃縮液即可，500ml的濃縮液不到50元，很方便）
G250考馬斯亮藍溶液（蛋白定量專用） 考馬斯亮藍G250 100mg
95％乙醇 50ml
磷酸 100ml
蒸餾水至 1000ml
配製時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和水，混勻後，用濾紙過濾，4℃保存。
0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g
蒸餾水至 100 ml
高溫滅菌後，室溫保存。
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解後-20℃保存。製作蛋白標准曲線時，用0.15 mol/L NaCl進行100倍稀釋成1mg/ml，-20℃保存。
10％分離膠和4％濃縮校
10％分離膠（兩塊膠，10ml） 4％濃縮膠（兩塊膠，5ml）
超純水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml
10％SDS 100 μl 50 μl
10%AP（過硫酸胺） 50 μl 25 μl
TEMED 5 μl 5 μl
加TEMED後，立即混勻即可灌膠。
（為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原來的2-3倍，根據實驗當時的溫度適當調整）
還原型5XSDS上樣緩沖液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g
SDS 0.5g
溴酚藍 0.025
甘油 2.5ml
混勻後，分裝於1.5ml離心管中，4℃保存。
電泳液緩沖液 Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
SDS 1g
蒸餾水至 1000ml
溶解後室溫保存，次溶液可重復使用3～5次。
（電泳液可以回收重復利用，一般將回收的電泳液加入垂直電泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鮮的電泳緩沖液）
（可以配製成10×電泳液緩沖液進行保存，稀釋10倍使用）
轉移緩沖液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸餾水至 1000ml
溶解後室溫保存，次溶液可重復使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影響轉移效率）。
（先用蒸餾水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然後再加入甲醇，最後補足液體。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比較困難）
（可以配製成2×轉移緩沖液進行保存，稀釋後使用）
10X麗春紅染液 麗春紅S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水楊酸 30g
蒸餾水至 100ml
使用時將其稀釋10倍。
TBS緩沖液 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸餾水至 1000ml
（可以配製成10×TBS緩沖液進行保存，稀釋10倍使用）
TBST緩沖液 20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混勻後即可使用，最好現用現配。
封閉液 脫脂奶粉（國產，光明牌） 5g
TBST 100ml
最好現用現配。
洗脫抗體緩沖液 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巰基乙醇) 700 μl（通風廚里加）
SDS 2g
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml
超純水至 100ml
配製時，在通風廚內進行。4℃保存。可重復使用1次。
（可用可不用）
顯影液（5X） 自來水（加熱至50℃） 375ml （以下葯品加到溫水中）
米吐爾 1.55g
亞硫酸鈉（無水） 22.5g
碳酸鈉（無水） 33.75g
溴化鉀 20.95g
補水至 500ml
配製時，上述葯品應逐一加入，待一種試劑溶解後，再加入後一種試劑。4℃保存。使用時用自來水稀釋至1倍。
（不需要自己配製，有錢的直接買柯達的顯影液，上千；沒錢的到專業的照相器材市場購買即可，很便宜，一包5毛錢左右）
定影液 自來水（50～60℃） 700ml （以下葯品按順序加入前者溶解後再加後者）
硫代硫酸鈉 240g
亞硫酸鈉（無水） 15g
冰乙酸 12.6ml
硼酸 7.5g
鉀明礬 15g（水溫冷至30℃以下時再加入）
加水定容至1000ml，室溫保存。
（不需要自己配製，有錢的直接買柯達的定影液，上千；沒錢的到專業的照相器材市場購買即可，很便宜，一包5毛錢左右）
抗體 用TBST稀釋至一定濃度使用，建議使用雜交袋（小商品市場購買，很便宜，可以多
買一點，但是務必注意質量，千萬不能漏，不然抗體就浪費了，在使用之前先檢查一下雜交袋的完整性）。
化學發光試劑 分A和B兩種試劑，有錢可以購買Amersham、Pierce或者Santa Cruz的，沒錢的話碧雲天的ECL也能湊合。
操作步驟
（一） 蛋白樣品制備
（1） 單層貼壁細胞總蛋白的提取：
1、 倒掉培養液，並將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然後再用移液器將其吸走）。
2、 每瓶細胞加3ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然後棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈後把培養瓶置於冰上。
3、 按1ml裂解液加10 μ PMSF（100mM），搖勻置於冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）
4、 每瓶細胞加400 μ含PMSF的裂解液，於冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。
5、 裂解完後，用干凈的刮棒將細胞刮於培養瓶的一側（動作要快），然後用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）
6、 於4℃下12000rpm離心5min。（提前開離心機預冷）
7、 將離心後的上清分裝轉移倒0.5min的離心管中放於-20℃保存。
（個人感覺上述方法可操作性有待加強，細胞中蛋白本來就很少，一瓶50ml的細胞有時按照實驗要求只能加100-200μ的裂解液，按照上述操作，直接用200μ裂解液進行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。本人是先用預冷的PBS（一般數毫升）加入後，用細胞刮刮下細胞，轉移至試管中，如果數瓶細胞是收集同一蛋白的，可以放在同一試管，離心後再將蛋白轉移到EP管中，這樣可操作性就比較強）
（2） 組織中總蛋白的提取：
1、 將少量組織塊置於1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
2、 加400 μ單去污劑裂解液裂（含PMSF）於勻漿器中進行勻漿。然後置於冰上。
3、 幾分鍾後再碾一會兒再置於冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。
4、 裂解30 min後，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然後在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝於0.5ml離心管中並置於-20℃保存。
（3） 加葯物處理的貼壁細胞總蛋白的提取：
由於受葯物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：
1、 將培養液倒至15ml離心管中，於2500rpm離心5min。
2、 棄上清，加入4ml PBS並用槍輕輕吹打洗滌，然後2500rpm離心5min。棄上清後用PBS重復洗滌一次。
3、 用槍洗幹上清後，加100 μ裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。
4、 將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝於0.5ml離心管中並置於-20℃保存。
（二） 蛋白含量的測定
（1） 製作標准曲線
1、 從-20℃取出1mg/ml BSA，室溫融化後，備用。
2、 取18個1.5ml離心管，3個一組，分別標記為0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。
3、 按下表在各管中加入各種試劑。
0μg
2.5μg
5.0μg
10.0μ
20.0μg
40.0μ
1mg/ml BSA
－
2.5μl
5.0μl
10.0μ
20.0μl
40.0μ
0.15mol/L NaCl
100μl
97.5μ
95.0μ
90.0μ
80.0μl
60.0μ
G250考馬斯亮藍溶液
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
4、 混勻後，室溫放置2min。在生物分光光度計上比色分析。
（2） 檢測樣品蛋白含量
1、 取足量的1.5ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1ml。室溫放置30min後即可用於測蛋白。
2、 取一管考馬斯亮藍加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混勻放置2分鍾可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標准曲線的程序下按blank測空白樣品。
3、 棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用無菌水洗一次。
4、 取一管考馬斯亮藍加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μ待測蛋白樣品，混勻後靜置2min，倒入扣乾的比色杯中按sample鍵測樣品。
注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次。可同時混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時間。測得的結果是5 μl樣品含的蛋白量。
（上述方法只是一家之言，可以自我變通，本人就不是按照上述方法進行的）
（三） SDS－PAGE電泳
（1） 清洗玻璃板：一隻手扣緊玻璃板，另一隻手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過後用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈後立在筐里晾乾。
（2） 灌膠與上樣
1、 玻璃板對齊後放入夾中卡緊。然後垂直卡在架子上准備灌膠。（可以用1%瓊脂糖在垂直電泳槽的左、右和下部封邊，五分鍾後重復一次，這樣可以保證基本不漏膠）
2、 按前面方法配10％分離膠，加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然後膠上加一層水，液封後的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要慢，否則膠會被沖變型。）
3、 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水並用吸水紙將水吸干。
4、 按前面方法配4％的濃縮膠,加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。將剩餘空間灌滿濃縮膠然後將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由於膠凝固時體積會收縮
減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠（其實說經常有點過了，補1-2次就行了，不補膠問題也不大）。待到濃縮膠凝固後，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
5、 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（沖洗的話個人感覺可以使用5ml的針筒，當然操作不能太粗暴了）
6、 測完蛋白含量後，計算含20-50μ蛋白（根據自己的實驗需要進行選擇，沒有固定的量）的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至200μl的EP管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15μl，加樣孔的最大限度可加20μ樣品）（其實大一點的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達到40μl，膠做得很好的話50μ也是問題不大的）上樣前要將樣品於沸水中煮5-10min使蛋白變性。（本人心得：可以使用PCR儀進行變性，加快速度，這樣就不用將水煮沸了，同時在水中煮蛋白樣品有下面弊端：1.EP管容易炸開，樣品丟失、2.容易進水，使樣品體積增加，超過電泳最大上樣量）
7、 加足夠的電泳液後開始准備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌數次，以免交叉污染）
（3） 電泳：電泳時間一般4～5 h，電壓為40V較好，也可用60V。（本人為了加快速度，濃縮膠時用80-100V跑，到分離膠以後用150-200跑，結果也不錯，總時間2h左右）電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜（如果目的條帶比較大的話，最好使用可視的蛋白marker，Fermentas的0441和0671比較好，就是有點貴。一般要讓目的條帶跑過分離膠的1/3比較好，不要局限於此說明）。
（四） 轉膜
（1） 轉一張膜需准備6張7.0～8.3cm的濾紙和1張7.3～8.6cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置於水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置於有超純水的平皿里，要使膜浮於水上，只有下層才與水接觸。這樣由於毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水裡，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水）（個人感覺其實轉膜之前浸濕一下就ok了，沒有多大問題，可能按照上述操作結果會更好）
（2） 在加有轉移液的搪瓷盤里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。
（3） 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回擀幾遍以擀走裡面的氣泡。（一手擀另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊於墊子上，註：個人感覺就墊1張濾紙也沒問題呀），一手固定濾紙一手用玻棒擀去其中的氣泡。
（4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬（應該邊撬邊用流水緩緩沖洗）。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，膠很易裂，要用巧勁）除去小玻璃板後，將濃縮膠輕輕颳去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋於濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒擀去氣泡。將膜蓋於膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下後不可再移動）並除氣泡。在膜上蓋3張濾紙並除去氣泡。最後蓋上
另一個海綿墊，擀幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行，要不斷的擀去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸後會發生短路。（轉移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）（最後做成的「三明治」千萬不能形成短路，不然有可能會短路燒壞轉膜裝置（價格不菲，尤其是進口的），第一次做的應請老手指教）
（5） 將夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉移時會產熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60V轉移2 h或40V轉移3 h。（1.實際上應該根據蛋白分子量的大小確定轉膜時間，對於小分子量的蛋白，轉膜時最好墊兩塊硝纖膜，以免轉膜過頭，因為如果第一張膜上蛋白質已經轉過了，第二張膜上還有蛋白質可以進行檢測；對於大分子量的蛋白，轉膜時電壓要高一點，一般80-100V，時間也要延長一點，開始最好也用兩塊膜，特別是務必注意加強降溫措施。當然轉膜是要摸條件的，最好剛開始做的時候摸個轉膜的時間梯度。如果由於時間原因來不及做下面實驗，可以在4度下12V轉膜過夜）（2.硝纖膜建議使用0.22μ的小孔徑膜，不容易轉膜過頭）（3.不同的轉膜裝置，轉移效率是不一樣的，所以換用轉膜裝置，最好再摸個條件）（4.轉膜時電極方向注意是膜正膠負）
（6） 轉完後將膜用1×麗春紅染液染5min（於脫色搖床上搖）。然後用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾乾備用。（一般不需要做這步）
（五） 免疫反應（個人建議：還是使用雜交袋進行一抗和二抗的孵育，節約抗體）
（1） 將膜用TBS從下向上浸濕後，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。
（2） 將一抗用TBST稀釋至適當濃度（在1.5ml離心管中）；撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪於實驗檯面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液後，將膜蛋白面朝下放於抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2h後，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
（3） 同上方法准備二抗稀釋液並與膜接觸，室溫下孵育1～2h後，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進行化學發光反應。
（六） 化學發光，顯影，定影
（1） 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min後，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min後，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。
（2） 在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當大小（比膜的長和寬均需大1cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上X-光片夾，開始計時；根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果；曝光完成後，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶後，即刻終止顯影。顯影時間一般為1～2min（20～25℃），溫度過低時（低於16℃）需適當延長顯影時間；顯影結束後，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為5～10min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液後，室溫下晾乾。（如果使用柯達的顯影定影液，時間很快的，顯影結束後最好先用事先准備好的自來水洗一下片子，然後再放到定影液中進
行定影，這樣可以延長定影液使用時間，從而節約定影液）
應注意的是：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結果產生影響。
（七） 凝膠圖象分析：將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。