⑴ PCR的操作注意事項
實驗操作注意事項：盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
(1)戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。
(2)使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的污染。
(3)避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面。
(4)操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度。
(5)最後加入反應模板，加入後蓋緊反應管。
(6)操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性。
(7)盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區。
(8)重復實驗，驗證結果，慎下結論。
⑵ PCR實驗過程中的注意事項
PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好於當日電泳檢測，大於48h後帶型不規則甚至消失。
PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
酶切分析：
根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離後，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法。 Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用於科研。 斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析。 氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱 核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標准反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；
5. 最後加入反應模板，加入後蓋緊反應管；
6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；
8. 重復實驗，驗證結果，慎下結論。
⑶ pcr需要注意的問題
1、PCR產物的電泳檢測時間：一般為48h以內，有些最好於當日電泳檢測，大於48h後帶型不規則甚至消失。
2、假陰性，不出現擴增條帶
模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。
模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增。
對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。
如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行PCR擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
3、假陽性
出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。
所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補後，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
4、出現非特異性擴增帶
PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。
其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。
5、出現片狀拖帶或塗抹帶
PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。
⑷ pcr過程是什麼
pcr過程是是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。具體過程如下：
1、變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃左右）雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。
2、退火；使溶液溫度降至50~60℃，模板DNA與引物按鹼基配對原則互補結合。
3、延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5'一3』方向復制出互補DNA。
PCR過程中需要注意：
1、Taq DNA 聚合酶：Taq 酶種類有很多，熱啟動酶，高保真酶，根據各自實驗的應用選擇合適的酶擴增，一般的反應，化學修飾的熱啟動酶即能很好的完成，化學修飾熱啟動酶能夠避免低溫下任何非特異性產物產生。
2、dNTP：四種 dNTP 的濃度要相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會引發鹼基的錯誤滲入。此外，dNTP能夠和體系中鎂離子結合，從而影響體系中鎂離子的濃度。
3、緩沖液：緩沖液一般隨酶提供，一般的 PCR 試劑盒包括 Taq 酶，緩沖液，dNTP，水。初次擴增，可以完全按照試劑盒的說明書操作，如果擴增結果有問題，可自己嘗試摸索實驗條件或重新設計引物提取模板擴增。
4、因空氣中和手上有一定污染源，操作過程中要戴手套，在干凈的環境中配置反應體系，防止空氣中的污染源。
5、PCR 擴增的水要經過高壓滅菌或 0.2um 濾膜過濾。
以上內容參考網路-實時熒光定量PCR
⑸ 在PCR擴增實驗中應注意什麼
1. 引物的質量是保證PCR特異性的關鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18～30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內部和引物之間不應含有互補序列；引物的鹼基順序與非擴增區域的同源性應小於70%；引物的3』末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴格的限制，故引物設計時可在5』末端加上限制性內切酶位點和/或啟動密碼ATG等；引物合成後必須純化以去除合成產物中的不完整序列、脫嘌呤產物、鹼基修飾鏈等「雜質」；引物的終濃度一般為0.2～0.5μmol/L，過低會影響反應產量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5』→3』聚合酶活性和5』→3』外切酶活性，但無3』-5』外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發生鹼基錯配的幾率為 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優勢在於反應產量高於其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經基因工程改造後，新創出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。數據顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/錯誤率) (數據來源：美國冷泉港實驗室)。
3. Mg2+濃度也是影響反應效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結合，不同反應體系中應適當調整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5～1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴增。
4. dNTP的濃度過高會增加鹼基的錯誤摻入率，使反應特異性下降；過低則會導致反應速度下降。使用時4種dNTP必須以等當量濃度配製，均衡的dNTP有利於減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環參數中應特別注意復性溫度，它決定引物與模板的特異性結合。退火復性溫度可根據引物的長度，通過Tm＝4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結合。
6. 減低污染的常規措施：①將PCR試劑、PCR產物及其他分子生物學試劑分開放置；②應保持樣品制備、PCR反應液配製與PCR產物分析三個工作區的獨立性；③使用陽性和陰性對照；④使用最高質量的水配製PCR實驗的所有反應試劑；⑤配製好的PCR反應試劑應分成小包裝儲存，每個包裝僅用於單次實驗；⑥制備樣品、配製試劑及反應液時必須戴手套；⑦實驗前一定要認真清潔加樣器等。
⑹ PCR實驗操作注意事項有哪些
1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室。
2、檢測設備必須符合標准PCR熒光實驗室設置要求
熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟體，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。
3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證。
4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓並取得合格證書;PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，並持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有「臨床基因檢測上崗證」。
5、必須在無菌無塵環境下進行操作PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標准化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果准確、確保實驗室衛生安全，確保實驗室長期穩定運行。
(6)pcr操作為什麼要戴手套擴展閱讀
PCR實驗的應用價值：
能夠對患者病情進行科學、准確、實時的掌控，並結合抗HBV與T細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐葯，病毒復制模板難以治療。
人體免疫耐受狀態不易打破等醫學難題，能迅速消除臨床症狀，而且有效抑制乙肝病毒復制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉換速度，殺滅血液及肝細胞內的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉肝纖維化、肝硬化進程。
⑺ 為什麼做pcr實驗一定要帶手套口罩
PCR實驗是可以產生毒的，出於健康考慮還是包裝嚴實點好，不論什麼實驗，在實驗室都要戴手套啊，口罩美國進,口普衛/欣還行，可以考慮使用。Tmall/